Изследване In vitro на Екстракт от Цисус Synetrim® CQ.

Изследване In vitro на Екстракт от Цисус  Synetrim® CQ.
                                                                                               ПРЕВЕДЕН ТЕКСТ                                          Изтегли оригиналния текст (PDF на англ. език)

 

Инхибиторни ефекти на извлечени компоненти от Cissus quadrangularis L. върху активността на липаза, амилаза и алфа-глюкозидаза in vitro

Хейзъл Шарпа, Джаки Холинсхеда, Барбара Б. Бартоломеоа, Юлиус Обенб, Алисън Уотсъна и Робърт Наша

а) „VASTox Chemical Genomics Limited”, Милтън Парк 91, Абингтън, Оксфордшир, Oxfordshire OX14 4RY, UK

б) Лаборатория по храни и хранителна биохимия, Департамент по биохимия, BP 812, Университета на Яунде І, Яунде, Камерун

 Получена на: 9 май 2007 г.; приета на: 21 юни 2007 г.

Стъблата на Cissus quadrangularis L (Vitaceae) се използват от векове в Азия и Африка като кулинарен зеленчук. Водният екстракт от стъбла и листа на Cissus quadrangularis съдържа флавоноиди и стилбени, които ограничават липаза, амилаза и алфа-глюкозидаза, и по тази причина могат да бъдат поне от части, свързани с твърдението, че това растение действа срещу затлъстяването. Инхибиторната активност на ензимите е изразена в нови флавоноиди (3-O-α-L-рамнопираносилрамноцитрин) (2) и стилбени (3-(4-хидроксибензилиден)-2-(2,5-дихидроксифенил)-1-(4-хидроксифенил)индан-4,6-диол) (7), четири познати сходни флавоноиди и един стилбен, изолирани от екстракта.

Ключови думиCissus quadrangularis L., затлъстяване, контрол на теглото, ограничаване на ензими.

Cissus quadrangularis L. (Vitaceae) е древно лечебно растение от по-горещите части на Цейлон и Индия. В Индия то се използва за спомагане на лечението на счупени кости [1]. В медицината на Аюрведа е познато като противоглистно, за диспепсия, тоник за храносмилане, аналгетично средство за заболявания на очите и ушите и за лечение на нередовна менструация и астма. В Камерун цялото растение се използва за хидратация, а екстакти от листата, стъблата и корените – за различни болести. Има сведения за употребата на C. quadrangularis  в контрол на затлъстяване и усложнения, свързани с метаболитен синдром [2], и за неговата антиоксидантна и пречистваща свободните радикали активност in vitro [3,4]. В днешно време различни формули съдържат екстракти от C. quadrangularis в комбинация с други съединения за поддържане на теглото и услужнения, причинени от тези състояния.

Фитохимичните анализи на C. quadrangularis разкриха, че то има високо съдържание на аскорбинова киселина, каротен, анаболитни стероидни субстанции и калций. Предишни доклади съобщават за третерпеноиди [5-8], стероиди [5,6,9-11], стилбени [11,12], флавоноиди [10], липиди [8] и иридоиди [11]. Ние съобщаваме за два нови компонента и ограничаването на ензими чрез тези и други елементи, което вероятно е свързано с лечебните претенции на растението.

Изсушено C. quadrangularis бе извлечено и разделено, за да се изолират и идентифицират съединенията, които могат да спомогнат за активността срещу затлъстяване или на растението, или на части от него, чрез ограничаване на дейността на липаза, амилаза и алфа-глюкозидаза [13]. 50 % воден етанолов екстракт от растението беше преведен през катионнообменна смола (Dowex 50 H+), от която инхибиторите бяха извлечени. Екстрактът беше обработен с НР20 смола и бяха получени три елемента: свободен, 25 % метанолов елуат и 10 % ацетон в метанолов елуат. Всички показани ензимни ограничения (табл. 1) и сходни химични профили, с изключение на 10 % ацетон в метанолов елуат, бяха подходящи за пречистване на съединенията.

Табл. 1 Ензимна инхибиторна активност.

таблица 1

По-нататъчната хроматография на тази част, чрез полярна флаш хроматография върху силициев диоксид и препаративна и полу-препаративна HPLC върху C18 показа седем съединения (фиг. 1) Пет бяха идентифицирани чрез съпоставка със спектроскопни данни в литературата [Dictionary of Natural Products (DNP) достъпен на CDROM] като кверцитрин (1), рамнитин (3), 3-O-α-L-рамнопираносилрамноцитрин (4), кверцитрин-3-О”-ацетат (5) и партеноцисин А (6).

Фиг. 1 Структури на съединенията, изолирани от C. Quadrangularis.

фигура 1

Съединение 2 имаше сходни UV, 1H и 13C NMR спектроскопни характеристики като 1, 3, 4 и 5 и по тази причина се сметна, че е флавоноиден глюкозид. Бяха добавени протони към отделни въглеродни атоми от pendant и HMQC спектъри. Бе разпознато присъствието на 1,4-двойнозаместено бензеново ядро от ясните въглерод и водород, COSY и HMBC корелации при характерни мета-разделени двойки при δ 6.84 и 7.67 ppm в 1H NMR спектър. Спектроскопните данни от 13C NMR показаха наличието на един метилови (δ 18.0) и пет метинови (δ 72.3, 72.4, 72.6, 73.6 and 103.9) въглеродни атома; връзката беше определена чрез COSY и HMBC спектроскопни данни и съвпадаше с рамнозна захарна съставка. Двойки от 1H NMR спектър на δ 6.10 и 6.27 бяха приложени на флавоноидното ядро и събирането на 2 Hz едни с други беше сходно с мета-заместване. 1H NMR спектърът беше идентичен с този на 4, различен само при едно проявление при δ 3.76 за 4, което бе причинено от метооксиден заместител в флавоноидното ядро. По тази причина бе определено, че стереохимията е идентична с 4, т.е. α-L-захарна връзка. Структурните данни съвпадаха с структурата 3-O-α-L-рамнопираносилкемфелон (2).

Съединение 7 имаше сходни UV, 1H и 13C NMR спектроскопни характеристики като 6 и по тази причина се сметна, че е стилбен. Бяха добавени протони към отделни въглеродни атоми от pendant и HMQC спектъри. Бе разпознато присъствието на две 1,4-двойнозаместени бензенови ядра от ясните въглерод и водород, и от COSY и HMBC корелации при характерни мета-разделени двойки приδ 6.81 и 7.07 и δ 6.81 и 7.29 в 1H NMR спектъра. HMBC корелациите на четворни въглероди приδ 156.9 и δ 156.5, съответно, индикират пара-хидроксилна група, свързана с бензеновите ядра. COSY корелациите между тройката при δ 6.27 и двойката при δ 6.41 в 1H NMR спектъра, заедно с малката константа от 2 Hz, индикират  симетрично тройнозаместено бензеново ядро. HMBC корелациите на четворни въглероди приδ160.1 индикират 3,5-дихидроксилно заместване на ядрото. COSY корелациите между протоните при δ 4.21 и δ 4.36 в 1H NMR спектъра индикират, че те са свързани и при съпоставка с 6 са разпознати като петчленното ядро на стилбена. Сигналът при δ 4.21 в 1H NMR спектъра показва HMBC корелации с двойката при δ 6.41 и ароматната единица при δ 7.16. Това съвпада с 3,5-дихидроксилното заместване на бензеновото ядро, свързано с него и което е на три връзки от заместена двойна връзка. HMBC корелацията между ароматната единица при δ 7.16 и мета-разделената двойка при δ 7.29 в 1H NMR спектъра е сходна с пара-заместеното бензеново ядро в тази точка. Сигналът при δ 4.36 в 1H NMR спектъра показва HMBC корелации с двойката при δ7.07 и четворните въглероди при δ 130.7, 139.0 и 143.8. Това е сходно с пара-хидроксилна заместеното бензеново ядро в тази точка и потвърждава присъствието на бензеново ядро, свързано с въглерода със сигнал при δ 4.21 и със заместената двойна връзка през два въглерода. Това е причината за връзката на пара-хидроксилфенилните и 3,5-дихидроксифенилни ядра, както е посочено във фиг.1. HMBC корелацията между ароматните двойки при δ 6.35 и 6.88 в 1H NMR спектъра една с друга, заедно с свързаната константа от 2 Hz, индикират, че те са мета една за друга и показват HMBC корелации с ароматни четворни въглероди, индикиращи дихидроксиленно заместване на ядрото. Сравнението с 6 показва, че те са част то стилбенното ядро. HMBC корелацията между сигналите при δ 6.88 и 4.36 в 1H NMR спектъра определя трите ароматни метинни връзки от метина с пара-хидроксифенилово ядро. 1H NMR спектърът за протоните на пет-членните ядра беше същият като при 6, по тази причина беше установена същата стереохимия. Структурните данни съвпадаха с структурата 3-(4-хидроксибензилиден)-2-(2,5-дихидроксифелин)-1-(4-хидроксифенил)индан – 4,6- диол (7).

Ограничаване на ензимна активност: Всички без един от флавоноидите показаха добро ограничаване на алфа-амилаза (табл.2). Кверцитрин (1) се различава от новия 3-O-α-L-рамнопираносилкемфелон (2) само с един хидроксилов заместител, но това води до намален ограничаване на алфа-амилаза. Въпреки това, метилацията на хидроксилово ядро, както при рамнитрина (3), или ацетилация на захарта, както при кверцитрин-3-0″-ацетат (5), води до възстановяване на инхибиторното въздействие. Всички флавоноиди показват сходни реакции при ограничаване на липаза, но ограничаването на алфа-глюкозидазата отново варира при различните структури.

Двата стилбени, 6 и 7, имат различни инхибитни профили. Партеноцисин А (6) деменстрира добро ограничаване на алфа-амилаза, докато новият 3-(4-хидроксибензилиден)-2-(2,5-дихидроксифелин)-1-(4-хидроксифенил)индан – 4,6- диол (7) се проявява като инхибитор специално на алфа-глюкозидазата. Интересно е да се отбележи, че 1 и 5 спомагат дейността на глюгозидазата.

Не сме определили стойностите на Ki за по-силните инхибитори, тъй като бяхме по-заинтересовани да определим отделните ефекти на всеки елемент от екстракта. Все пак, в такива проучвания е важно да се търси специфичност на ограничаването, за да се докаже, че то не е неподходящо за лечение неспецифично взаимодействие с протеини. Тук сме показали, че съединенията деменстрират специфично ограничаване на различни ензими. Ограничението на липазата не се покачи над 60 %, дори и с употребата на предлагания на пазара инхибитор Orlistat® с най-висока концентрация. Изглеждаше, че липазата и амилазата са по-податливи на ограничаване чрез съединенията на C. Quadrangularisотколкото алфа-глюкозидазата.

Присъствието на няколко компонента, демонстриращи ограничаването на амилаза, липаза и глюкозидаза, показват, че растението може да има ефект върху способността на стомашно-чревния тракт да използва ефикасно растението и други хранителни източници. Инхибитори на липаза като Orlistat® и глюкозидази като Glyset® и Acarbose® са използвани като лекарства за затлъстяване и диабет тип 2. Въпреки това, те често имат странични ефекти и комбинацията от няколко елемента вC. Quadrangularisработещи върху различни ензими, би имала по-поносим резултат. Макар, че комбинираният ефект на водния екстракт беше ограничаване на глюкозидазната активност, полезно е да се отбележи, че 1 и 5 всъщност спомагат дейността на глюгозидазата. Това може би се дължи на алостеричните ензими. Макар и ефектът на засилена дейност на глюгозидазата чрез някои компоненти върху контрола на теглото и диабета е труден за разбиране, има голям брой алфа-глюкозидази в стомашно-чревния тракт и в клетките, и ограничаването на някои от тях може да бъде полезно за контрола или на теглото, или на диабета, а засилена дейност на някои глюгозидази може да помогне по други начини. Тук използвахме само един вид алфа-глюкозидаза и съединенията могат да въздействат различно на други алфа-глюкозидази. Способността на отделните идентифицирани елементи да достигнат местата на ензимна активност също ще варират и ще бъдат повлияни от индивидуални разлики и без съмнение от вариации в други храни, приемани заедно с C. Quadrangularis и продукти, в които то се съдържа.

Табл. 2 Ензимна инхибиторна активност.

таблица 2

 Бе показано, че ограничаването на алфа-глюкозидази може да бъде използвано за лечението на други заболявания освен диабет тип 2 и контрол на теглото [14]. В частност, тези инхибитори са били разглеждани като потенциални анти-вирусни и анти-ракови съставки и вероятно ограничаването на алфа-глюкозидази чрез C. Quadrangularis обяснява широката му традиционна употреба. Спомагане на специфична глюкозидазна активност може да бъде лечебно, където тези ензими са с намален брой.[14]

 Експериментално

Определяне на структурата: Определянето на структурата беше извършено с NMR спектроскопия (Bruker DRX500) за пълно 1H and 13C възлагане. NMR сигналите на протон и въглерод бяха определени с обширни 2D NMR спектроскопни експерименти, включително 1H-1H COSY, HMQC и HMBC. LCMS (Waters Integrity) предостави EIMS  данни за молекулното тегло и/или частта от възлагането.

Търсенето в писмените данни бе извършено с Dictionary of Natural Products (DNP) достъпен на CDROM.

Растителен материалCissus quadrangularis беше доставено изсушено от Камерун. № 18668/SRF/Cam, идентифициран от Камерунския национален хербарий, Яунде, Камерун.

Извличане и изолация: Изсушеното Cissus quadrangularis (2,3 кг) беше извлечен с 50 % етанолов разтвор (10 л) за една нощ. Филтрираният екстракт беше сложен в две колони за катионен обмен (Dowex 50 H+, 700 cм3), където инхибиторите не бяха оставени (табл. 1). Екстрактът (8 л) беше поставен в HP20 картридж (6 х 75 см), уравновесен с 50 % воден метанол (5 л) и 25 % воден метанол (3 л), последван от 10 % ацетон в метанол (6 л), за да се получат 3 активни фракции:  свободна (37 г), 25 % метанолов елуат (27 г) и 10 % ацетон в метанолов елуат (14 г). Всички демонстрираха ензимно ограничение и сходни химични профили, но фракцията от 10 % ацетон в метанолов елуат беше по-подходяща за пречистване на съединенията. 10 %-ят ацетон в метанолов елуат екстракт беше свързан с силициев диоксид и прибавено към KP-Sil™ Flash 75S картридж (7,5 х 9 см) уравновесен с хептан (5 л) и 75 % хептан в етилов ацетат (1 л), 50 % хептан в етилов ацетат (1 л), 25 % хептан в етилов ацетат (1 л), 100 % етилов ацетат (1 л) и 95 % етилов ацетат в метанол (1 л), за да се отделят пет фракции.

Препаративна HPLC на фракция 4, извършена с Water`s Nova-Pak® HR C18 колона (2 x (40 x 100 mm) в серии, 6 μm, 60A0) с 55 mL/мин и мониторна честота 225 nm с градиент ацетонитрил/вода (80% вода : 20% ацетонитрил,  съдържащ 0.1% TFA, към 65% вода : 35% ацетонитрил, съдържащ 0.1% TFA за 15 мин), показа партеноцисин А (6) (25 мг). По-нататъчното пречистване на тази фракция с Water`s Nova-Pak® HR C18 колона (25 x 100 mm, 6 μm, 60A0) с 15 mL/мин и мониторна честота 225 nm с градиент метанол/вода (55% вода : 45% метанол,  съдържащ 0.1% TFA, към 30% вода : 70% метанол, съдържащ 0.1% TFA за 15 мин) показа кверцитрин-3-O´´-ацетат (5) (12 мг) and 3-(4-хидроксибензилиден)-2-(2,5-дихидроксифенил)-1-(4-хидроксифенил)индан-4,6-диол (7) (19 мг). Препаративна HPLC на фракция 5, извършена с Water`s Nova-Pak® HR C18 колона (2 x (40 x 100 mm) в серии, 6 μm, 60A0) с 55 mL/мин и мониторна честота 210 nm с градиент ацетонитрил/вода (80% вода : 20% ацетонитрил,  съдържащ 0.1% TFA, към 60% вода : 40% ацетонитрил, съдържащ 0.1% TFA за 20 мин), показа кверцитрин (1) (35 мг), 3-O-рамноспираносилкемпферол (2) (13 мг), рамнитрин (3) (10 мг) и 3-O-αLрамнопираносилрамноцитрин (4) (13 мг).

Инструменти и реактиви, използвани за биологични изследвания: Пречистените съединения и екстракти бяха направени на разтвори от 2 мг/мл във вода, ако бе нужно с капка диметил сулфоксид за разтворимост.

Липаза: Сигма липаза-PS (кат. № 805-А). Човешка панкреасна липаза беше разтворена в съотношение 1.5:5 преди употреба. Изследването беше проведено на 20°C, с 10μл тестово съединение, 5 μл ензимен разтвор, 90 μл субстрат и 30 μл активатор реактив. Формиране на цветовете беше измерено при 550 nm след 30 минути.

Амилаза: Сигма INFINITY пудра реактив (кат. № 568-20); Сигма алфа-амилаза (A6255, свинска панкреасна амилаза като солена суспенсия) резтворена до 35 единици/mл. Изследването беше проведено на 20°C, с 10μл тестово съединение, 10 μл ензимен разтвор и 150 μл INFINITY реактив. Формиране на цветовете беше измерено след 5 минути, след което финалната абсорбация беше измерена при 405 nm като краен резултат.

Алфа-глюкозидаза: Сигма алфа-глюкозидаза (G5003, от Saccharomyces. cerevisiae) при 2 единици/mл в фосфатен неутрализатор pH 6.0. Сигма p-нитрофенил-α-Dглюкопиранозид, 5 mM в фосфатен неутрализатор pH 6.0. Изследването беше проведено на 20°C, с 10μл тестово съединение, 10 μл ензимен разтвор и 50 μл субстратен разтвор. Реакцията беше проведена за 7 минути, формиране на цветовете беше измерено при 415 nm, след това беше добавен 80 μл 0.4 M глицинен разтвор, за да се спре реакцията. Бяха проведени други глюкозидазни изследвания с ензими от Сигма и подходящи p-нитрофинилови субстрати [13].

3-O-α-L-рамнопироносилкемпферол (2)

3-(4-хидроксибензилиден)-2-(2,5-дихидроксифелин)-1-(4-хидроксифенил)индан-4,6-диол (7)

Free PageRank Checker